任务目标：
本系列课程学习的文章是：AKAP95 regulates splicing through scaffolding RNAs and RNA processing factors. Nat Commun 2016 Nov 8;7:13347. PMID: 27824034 很容易在文章里面找到数据地址GSE81916 这样就可以下载sra。
文章主要内容
测序物种
人类，小鼠；
实验类型
高通量测序
摘要
pre-mRNA的可变剪切与高等生物基因表达的复杂性有关，但是可变剪切位点的选择却未研究清楚。作者在以前的研究中发现了一个染色质相关的蛋白AKAP95（AKAP8）在强化染色质转录方向有着明显的影响。在本文的研究中，APAKP95能与许多涉及转录和RNA加工的因子相互作用，调节pre-mRNA的剪接。AKAP95直接促进内源基因FAM126A的特异性外显子的体外剪接和包含。 AKAP95N-末端富含YG的结构域在与RNA加工因子（例如hnRNP蛋白）结合的过程中有着重要的作用，它的锌指结构域对于pre-mRNA的结合至关重要。基因组结合的分析显示，AKAP95优先结合人类转录组中大量pre-mRNA的近端内含子区域，AKAP95的敲除能导致多外显子增加的减少。AKAP95还可以选择性地协调hnRNP H/ F和U蛋白来调节可变剪接事件。进一步表明，AKAP95与自身直接相互作用。总之，实验的研究结果表明，AKAP95是pre-mRNA剪接的新型，并且是正向调节因子，它有可能是一个转录和剪接调节整合子，并且实验提出了一个模型，即AKAP95通过支架RNA和RNA加工因子调节pre-mRNA剪接，并促进剪接位点之间的信息交流。
原英文摘要：
Alternative splicing of pre-mRNAs significantly contributes to the complexity of gene expression in higher organisms, but the regulation of the splice site selection remains incompletely understood. We have previously demonstrated that a chromatin-associated protein, AKAP95 (AKAP8), has a remarkable activity in enhancing chromatin transcription. In this study, we have shown that AKAP95 physically interacts with many factors involved in transcription and RNA processing, and functionally regulates pre-mRNA splicing. AKAP95 directly promotes splicing in vitro and the inclusion of a specific exon of an endogenous gene FAM126A. The N-terminal YG-rich domain of AKAP95 is important for its binding to RNA processing factors including selective groups of hnRNP proteins, and its zinc finger domains are critical for pre-mRNA binding. Genome-wide binding assays revealed that AKAP95 bound preferentially to proximal intronic regions on a large number of pre-mRNAs in human transcriptome, and AKAP95 depletion predominantly resulted in reduced inclusion of many exons. AKAP95 also selectively coordinates with hnRNP H/F and U proteins in regulating alternative splicing events. We have further shown that AKAP95 directly interacts with itself. Taken together, our results establish AKAP95 as a novel and mostly positive regulator of pre-mRNA splicing and a possible integrator of transcription and splicing regulation, and support a model that AKAP95 regulates pre-mRNA splicing via through scaffolding RNAs and RNA processing factors and facilitating the splice site communication.
样本信息
样本1-8是RIP-seq的数据，研究的是AKAP95与转录组的结合，样本9-15是mRNA-seq的数据，研究的是在293细胞或小鼠ES细胞中敲减了AKAP95的数据（其中9-11是293细胞的数据，有3个，12-15是小鼠ES细胞的数据，有4个）。
文章思路
1.AKAP95的N末端区域参与该蛋白与RNA加工因子的结合，这些RNA加工因子包括hnRNPs。
2.APAK95与许多RNA加工因子的结合暗示了AKAP95在RNA加工方面发挥了作用，这些作用包括pre-RNA剪接。实验结果表明，AKAP95直接调控minigene pre-mRNA剪接，AKAP95的N末端与ZFs是其功能发挥的结构域。
3.为了寻找AKAP95剪接调控的内源靶点。经过一系列实验表明：AKAP95和hnRNP F参与调节FAM126A外显子11的剪接（实验中提到了敲减AKAP95后，FAM126A的外显子11会被跳过，而在野生型中则正常剪接）。
4.利用深度测序的方法寻的找内源AKAP95与人类转录组的结合。测序手段是RIP，其结果是发现AKAp95能与pre-mRNAs结合。
5. （核心，也就是这个笔记学习的部分）问题：评估AKAP95对可变剪接的全局影响，实验手段是：①人类294细胞和小鼠ES细胞中敲减了AKAP95基因->②RNA-seq->③DEXseq分析。AKAP95的敲减会导致更多的外显子使用（exon）减少，这表明AKAP95会全局促进外显子增加（exon inclusion）。看文献我的理解是，有了AKAP95基因后，该基因的表达产物会导致FAM126A的外显子10，11，12连接起来，如果敲低了AKAP95这个基因，FAM126A的外显子10与12连接起来，会跳过外显子11。因此AKAP95的功能就在于调节FAM126A的可变剪接。exon inclusion我的理解是，外显子的利用，以此文献为例说明，exon inclusion指的就是FAM126A的外显子11的利用，AKAP95会促进AKAP95外显子11的利用，如果没有AKAP95，则FAM126A的外显子10就会跳过外显子11，与外显子12连接起来，exon inclusion就降低。
6.后续的实验作者又研究了AKA95的一些作用机理，略。
文章结果
a.b图
a图是火山图。火山图常用于展示显著差异表达的基因，这里有两个关键词：显著是指P<0.05，差异表达一般我们按照fold change(倍数变化)="">=2.0作为标准。
当我们拿到基因表达的P值和倍数后，为了用火山图展示结果，一般需要把倍数进行Log2的转化（下图a的x轴），比如某基因在实验组表达水平是对照组的4倍，log2（4）=2，同样的如果是1/4，也就是0.25，转换后的结果就是-2。
P值进行-log10的转化，-log10（0.01）约等于2，由于P值越小表示越显著，所以我们进行-log10（P value）转化后，转化值越大表示差异约显著，比如-log10（0.001）=3 > -log10(0.01)=2 > -log10(0.05)=1.30（下图a的y轴）。
火山图有三种颜色，黄色与红色都是Padj小于0.01的基因（P值经过了FDR校正，即false discovery rate）。红色又表示基因变化超过2倍的基因。b图是饼图，它表示外显子使用(exon usage)的增加与降低数目。
c.d图
e图
f图
文章所用的生信方法
在后文的Bioinformatic analyses部分
比对
比对软件：TopHat (v2.0.13)
参考基因组：human reference genome (GRCh37/hg19)
GTF文件： GTF version GRCh37.70
只保留MQ >30的map结果
Picard-tools (v1.126)： 计算平均插入大小(mean insert sizes)和标准差
read count: 软件：HTSeq v0.6.0
差异表达分析
DESeq (v3.0)
DEXSeq (v3.1)
富集分析
GO分析：DAVID (http://david.ncifcrf.gov/)
数据下载
进入NCBI的GEO数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
搜索GSE81916，如下所示：
输入GSE81916，单击Search即可，见到数据说明及下载页面，如下所示：
下面有一段话是对这些数据的描述，即：
>
Overall design Samples 1-8 are RNA-immunoprecipitation > (RIP)-seq to determine AKAP95 binding to the
transcriptome. Samples 9-15 are mRNA-seq to determine
effect of AKAP95 knockdown in human 293 cells (9-11) or > mouse ES cells (12-15).
大意就是样本9-15是mRNA-seq的数据，而样本1-8是RNA免疫组化的数据。我们只需要9-15的数据，单击红框链接即可进入数据下载页面，如下所示：
单击第一行的SRP/SRP075/SRP075747右侧的ftp，即可进入数据下载界面：
现在下载SRR3589956-SRR3589962的7个数据（3个人类，4个小鼠），命令如下：
此命令是将数据下载到disk2/sra的目录下，
|
|
当时觉得数据下载慢，我就直接用迅雷下载了，数据下载后如下所示：