前言
microRNA（后方简称miRNA）的长度比较短，通常是20nt到24nt长度，因此用常规的qPCR法很难对其直接定量。现在常用的对miRNA的定量方法主要有三种，分别为加尾法，茎环引物法，探针法。这篇笔记主要以mmu-miR-30d-50为例总结一下这前两种方法，因为探针法的原理与实验步骤我以前总结过。就我自己的看法，这三种方法最根本的原理就是延长miRNA。
茎环引物法
原理
茎环引物是一种能够自身环化的长引物，它的长度约为45bp。下面是茎环引物的示意图：
茎环引物的使用流程：
第一步：在反转录过程中，茎环逆转录引物（需要自己设计）与miRNA结合，反转录为cDNA；
第二步：在qPCR过程中，茎环结构打开，两条引物与打开茎环结构结合，其中一条引物与茎环引物上的公共序列结合，另外一条与相应的miRNA序列结合（需要自己设计），其他的miRNA也可以使用公共引物。
mmu-miR-30d-5p的茎环引物设计
第一步，在www.mirbase.org数据库中查询mmu-miR-30d-5p的成熟体序列（5’->3’）如下所示：
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将U转换为T，就如下所示：
第二步，设计茎环引物，茎环引物由两部分构成，一部分是通用的序列（通用序列有很多种，这里只列举一种），如下所示：
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另外一部分是针对某个miRNA特定序列，这一部分的序列是6个碱基，我们设计的是miR-30d-5p，从它的3‘端，开始数取6-8个序列，即GAAGGTCA，取它的互补序列，即为CTTCCAGT，将这段序列与茎环引物的通用序列，结合，就成了miR-30d-5p的反转录引物，如下所示：
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这个引物是在反转录的时候使用，它在反转录过程中的示意图如下所示：
第三步，设计qPCR引物，正向引物，每个正向引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。即：上游引物为5‘- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ，自miRNA5’端抄起，14-16个或13-14个，这里就抄14个碱基。 通俗的说就是：保护性碱基（用来调GC含量的）+miRNA 5 端的13-16个碱基（不要抄到最后那6-8个上去了，意思就是不要与RT那段重叠了），因此miR-30d-5p的qPCR正向引物序列就是：
反向引物，就是茎环引物上的一段序列，这里直接写为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'（就是茎环引物上的一段序列）。这两条引物在qPCR中的反应过程如下所示：
RNA提取的实验材料
Trizol（Thermo Fisher Scientific）
RNAase-Free水
无水乙醇（重庆川东化工有限公司）
氯仿（成都市科龙化工试剂厂）
异丙醇（成都市科龙化工试剂厂）
qPCR试剂盒（Takara，货号：RR820A）
反转录试剂盒（Takara，货号：RR037A）
qPCR实验过程
1.提取RNA
提取RNA，按照常规的Trizol法提取即可，最终提取并测完浓度后，将RNA样本稀释到300ng/uL的浓度，并分装到3个EP管中，并取一部分出来，进行质控。质控的内容包括：1.2%的琼脂糖电泳，电压120V，40分钟，上样量200ng。
2. 反转录
反转录采用Takara的反转录试剂盒，这个试剂盒是常规的反转录试剂盒，在反转录miRNA的时候，不需要试剂盒里面的2个引物，即成分3（Oligo dT primer）和成分4（Random 6 mers），使用自己设计的茎环引物进行反转，反转体系如下所示（20μL体系）：
| 成分 | 体积 |
| —————————————- | —— |
| 5XPrimeScript Buffer | 4 |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1 |
| 茎环引物 | 1 |
| 总RNA | 1 |
| 无RNAase水 | 20μL |
PCR程序为：
- Step 1：37℃, 15min
- Step 2：85 ℃, 5 sec
- Step 3：4 ℃, 5min
3. qPCR反应
反应体系如下所示：
| 组分 | 体积(μL) |
|---|---|
| 2×SsoAdvanced SYBR Green Supermix | 10 |
| Forward Primer(10μM) | 1 |
| Reverse Primer(10μM) | 1 |
| cDNA Template | 1 |
| ddH2O | To 20μL |
(2)PCR反应条件：
第一步：预变性条件95℃/10s；1 cycle；
第二步：PCR反应条件95℃/5s，60℃/30s，70℃/20s；40 cycles；
第三步：融解曲线分析95℃ 0s，20℃/s，65℃ 15s，20℃/s ，95℃ 0s ，0.1℃/s。
分析数据即可。
茎环引物法的优缺点
茎环引物法的优点就在于特异性强，成本低。缺点就是一次只能针对一种特定的miRNA进行检测，而加尾法则能够对miRNA进行批量筛选。
加尾法
原理
加尾法的根本原理也是延长miRNA，然后再用上下游引物来进行qPCR。
在这里，还以miR-30d-5p为例，以及Takara的一个miRNA试剂盒为例说明一下加尾法的原理，参考资料主要是该试剂盒的说明书，即Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis and SYBR® qRT-PCR User Manual。这个试剂盒里面有这些成分：①mRQ Enzyme Mix；②mRQ Buffer (2X)；③mRQ 3’ Primer (10 μM) ；④U6 Forward Primer (10 μM)；⑤U6 Reverse Primer (10 μM)。
其中，①mRQ Enzyme Mix中含有poly(A)聚合酶，该酶向miRNA的3’末端添加poly(A)尾，此外还含有SMART MMLV逆转录酶，这个酶主要用于将加了poly(A)的RNA反转录为cDNA。②mRQ buffer是缓冲液，很好理解；③mRA 3‘ Primer这个我猜测可能是进行qPCR反应时的公共引物；④与⑤是U6的内参，这个也好理解。
整个反转录过程如下所示：
以上就是加尾法对miRNA进行检测的原理。这里只是以mmu-miR-30d-5p为例说明了一下，其实它也可以是miR-770-5p，也可以是miR-21-3p等，一次反转录几乎能够把细胞内的所有miRNA都给反转录成cDNA。因此，如果批量对miRNA进行qPCR筛选的话，加尾法是一种比较合适的方法，它只需要设计针对某个miRNA的特异引物即可，这样一次反转录生成的cDNA就可以重复做多个miRNA的检测。
加尾法的上游引物设计
从原理图上可以知，例如针对miR-30d-5p的引物其实就是miR-30d-5p序列本身，只是把U变成了T。例如miR-30d-5p的成熟体序列为UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG，那么它的加尾法上游引物就是TGTAAACATCCCCGACTGGAAG。
qPCR反应
加尾法的qPCR反应体系跟普通的qPCR体系一样，程序也类似（如果一次筛选大量的miRNA，则需要优化一下退火温度）。
加尾引物的优化
前面的加尾法只是一种非常粗糙的引物设计方法，因为不是所有的miRNA序列，用T替换U后，就可以直接当作引物的，加尾法的引物必须要经过优化。
引物的设计基本原则
加尾法上流引物的设计原则也要遵循普通的PCR引物设计标准，如下所示：
- 引物长度：与miRNA长度相似，20-25mer；
- Tm值，约为60摄氏度，可以用Oligo软件分析，也可以使用一些在线的软件进行分析；
- GC含量：40~60%。
现在设计一个mmu-miR-21-5p的引物，在mibase数据库中查询，它的序列如下所示：
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用T替换为U，如下所示：
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把这条序列放到Oligo中评估一下：
第一，先评估一下是否构成二聚体，操作为Analyaze->Duplex Formation->Current Oligo，结果如下所示：
第二，评估一下引物的构成与Tm值，Analyaze->Composition&Tm->Current Oligo，如下所示：
从这个结果来看，Tm值属于正常，但GC含量过低，有38.1%，此时需要进行调整，在5’端添加GC，调整后的序列如下所示：
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调整后的Tm值与GC含量如下所示：
再看一个案例，has-ｍiR-615-5ｐ，它的序列如下所示：
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用T替换U，如下所示：
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查看一下自身结合的发卡结构，如下所示：
查看一下Tm值与GC含量，如下所示：
此时需要对引物进行调整，在5’端删除GGGGG，在3‘端添加AAA，调整后的序列如下所示：
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再查看一下发卡结构，如下所示：
查看一下Tm值与GC含量，如下所示：
已经调整到正常范围。
总结：
- 加尾法的上流引物设计方法为：找到原始序列->使用T替换为U
- 在Oligo中评估这个序列，主要查看自身的发卡结构，引物二聚体形成，Tm值与GC含量
- GC含量的调整要在引物的5’端与3’端进行。