蛋白标签

发表于 | 分类于
| 字数统计: 2,037 | 阅读时长 ≈ 7

蛋白标签（proteintag）是什么

蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

蛋白标签的分类

蛋白标签大体可分为三大类：遗传标签、in vivo标签和in vitro标签。最常见的是遗传标签，即c-Myc、FLAG等。将目的基因克隆到含有标签的载体上，以便下游通过抗体或荧光检测。同时，标签的存在也方便了蛋白纯化。

常用的蛋白标签

Flag标签

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

注：Kozak序列全称是Kozak consensus sequence, Kozak consensusor Kozak sequence，是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。对应于原核生物的SD序列。

Flag标签优点

  1. FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质；

  2. 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高；

  3. FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

  4. 融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

His6标签

His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

His6标签优点

  1. 标签的分子量小，只有~0.84KD，一般不影响目标蛋白的功能；

  2. His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化；

  3. His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

  4. His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；

  5. 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

例如在以下的这篇文章中，就是使用了his标签来做蛋白质的相互作用：

1
Li, Y., et al. (2016). "Analysis of the Rab GTPase Interactome in Dendritic Cells Reveals Anti-microbial Functions of the Rab32 Complex in Bacterial Containment." Immunity 44(2): 422-437.

在文献中，研究者是将6His标签放到了Rab分子前面。

GST标签

GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个：

第一，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；

第二，另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。

GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测

c-Myc-tag

　　C-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

HA标签

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

EGFP蛋白标签

这类蛋白标签属于荧光蛋白（其中EGFP的激发波长为488nm，发射波长为507nm）。

这类荧光蛋白还包括EYFP（激发波长为513nm，发射波长为527nm），EYFP是由野生型黄绿色荧光蛋白YFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于YFP，eYFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。。

eCFP标签蛋白为增强型青色荧光蛋白eCFP，激发波长为433nm或453nm，发射波长为475nm或501nm，其是由野生型青色荧光蛋白CFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于CFP，eCFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。

荧光蛋白标签常用于慢病毒包装来构建稳转或敲除细胞系，通常在目的蛋白的N端进行标签，也就是在目的蛋白ATG密码子的上游。这类蛋白标签的优点在于：

  1. 不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。
  2. 其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。
    同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。
  3. 其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

以下是部分蛋白标签的特性介绍：

标签 纯化 促进溶解度 抗体效价 细胞标记
His6 + +/- +/-
Flag + +/- +
GST + + +
MBP + ++ +
His-MBP ++ + +
HA +
eGFP/CFP/YFP +++
Myc +
His-Myc + +
His-AviTag™ ++ ++ ++
Sumo +++ +
His-Sumo ++ ++ +
SNAP-Tag™ ++ + +++
Halo Tag™ ++ + +++