CoIP实验笔记

发表于 | 分类于
| 字数统计: 917 | 阅读时长 ≈ 4

前言

研究蛋白相互作用的方法常见的有Co-IP（全称为Co-Immunoprecipitation，即免疫共沉淀），Pull-down， 酵母双杂交系统，噬菌体展示技术，等离子共振技术，荧光通量转换技术，Duolink技术。

背景知识

蛋白A与蛋白G

Co-IP实验材料

这里以CST公司的为例说明一下，CST公司的Co-IP试剂有：

1
2
3
4
73778--Protein A Magnetic Beads（磁珠）
9863 --Protein A Agarose Beads（琼脂糖珠）
70024--Protein G Magnetic Beads
37478--Protein G Agarose Beads

Co-IP实验流程

实验流程参考CST的9863这个试剂的流程，流程如下所示：

本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 收集并裂解细胞

  1. 胰酶消化细胞，收集细胞后再用PBS洗一遍；
  2. 加RIPA裂解液裂解细胞；
  3. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中，上清液即为细胞裂解物；

B. 细胞裂解物预澄清

  1. 涡旋振荡，以混合磁珠。
  2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
  3. 在 4°C 下，旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗（按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制）加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下，旋转孵育过夜。
  2. 添加 protein A 琼脂糖（10–30 µl 的 50% 珠浆）。在 4°C 下，旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析（C部分）。

C.样品分析

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。

  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。

  3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。

  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

参考资料

  1. Protein A Magnetic Beads #9863