前言
免疫荧光是生命科学中的一项常规实验，以下是我做过的免疫荧光（细胞）的实验流程，这里给需要这项技术的同学做一个参考。
实验材料与试剂
细胞：RAW264.7细胞系
马血清：（封闭用）（中杉金桥，货号：ZLI-9023）
抗体稀释液：中杉金桥，货号：ZLI-9028-20ml，呈绿色，用于稀释一抗
二抗稀释液：碧云天，货号P0023D
共聚焦小皿：35mm， In Vitro Scientific，货号：35mm，D35-14-1-N；如果需要细胞爬片的话，可以使用盖玻片，国产就行，但盖玻片要用重铬酸钾泡24小时，随后用双蒸水清洗，并置于含有75%酒精的蓝盖瓶中，用于灭菌，使用之前使用PBS清洗3遍。
- 二抗：优选CST或ThermoFisher的，使用过一些国产的免疫荧光二抗，效果不好，这里不推荐
- DAPI：染核，国产进口均可。
实验流程
1) 吸掉共聚焦小皿或培养板中的培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3 min，然后再做固定；
2) 固定：加入4%多聚甲醛(使用PBS配制)固定10分钟；
3) 透膜加封闭：10%马血清+0.1% Triton X-100 (使用PBS配制)室温通透30min，吸掉封闭液，不用洗涤，如果此时不想孵一抗，直接就放到4度冰箱即可；
4) 一抗：滴加足够量适宜浓度的一抗（稀释比例通常是1:200），4℃孵育过夜；若有两种一抗（要是不同种属的）则同时孵育，两种二抗亦同时孵育（二抗同时使用时最好是同一种属）。
5) 次日，除去一抗，使用PBS轻洗细胞3×5 min。
6) 二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗（稀释比例1:2000），37℃，60 min（从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行）。
7) 除去二抗，使用PBS轻洗细胞3×3 min。
8) 复染核： 0.5ug/ml DAPI（或200nM Hoechst 33342）避光孵育5min。
9) 使用PBS轻洗细胞4×5min，洗去多余的DAPI。
10) 封片：用浓度50%甘油；
11) 上机拍照，如果不能及时拍照，放到4度冰箱保存即可，最长的时间我放的时间有近2周。
如果免疫荧光图片效果不行，可以根据实际情况调整封闭，一抗，二抗的条件。