Western Blot笔记

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试剂配置

电泳液(10X)

称量
Tris 30.3 g
Glycine 144 g
SDS 10g

转膜液(10X)

成分 称量
Tris 58g
Glycine 29g
SDS（电泳级） 3.8g

TBS(10X)

成分 称量
NaCl 80g
1M Tris-HCl((PH8.0) 24g

使用时，取100mL TBS(10X)，加入900mL去离子水，再加入1mL 的Twen20（Sigma，货号：T2700-1L）。

其它试剂

封闭液

5%脱脂奶（BD:232100），或索莱宝（货号D8340）

2.5g脱脂奶粉加入20ml的TBST Wash Buffer中，搅拌溶解，4℃或-20℃保存。

封闭液也可以直接使用商业公司的产品，例如碧云天的QuickBlock封闭液，货号：P0228

一抗二抗稀释液

一抗稀释液：碧云天Western一抗稀释液（货号：P0023A）

二抗稀释液：碧云天Western二抗稀释液（货号：P0023D）

或用5%脱脂奶粉

常用内参一抗与二抗

一抗：鼠源小鼠actin抗体（碧云天，货号：AA128）

一抗：兔源小鼠Gapdh抗体（碧云天，货号：AF1186）

兔抗鼠Vinculin(CST，货号：13901S)

兔抗鼠beta-tubulin(CST，货号：15115S)

羊抗兔二抗（鼎国，货号：SA00001-2）

羊抗小鼠二抗（碧云天：货号：A0216）

羊抗兔二抗（CST，货号：7074S）。

(4) 蛋白Marker

ThermoFisher protein Marker（货号：26619）

其它试剂

BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，货号：P0010）
Twen20（Sigma，货号：T2700-1L）。

实验步骤

（一）样本裂解

  1. 将2×106的细胞悬液离心后，除去上清，加入RIPA溶液40µL（根据细胞的数目而定），反复吹打，随后放冰上静置10分钟；（注：RIPA是一种传统的细胞组织快速裂解液。成分为 ①50 mMTris-HCl(pH 7.4)② 150 mM NaCl③1% NP-40）；
  2. 12000g，离心10min，4℃，取上清，检测蛋白含量。

（二）蛋白浓度测定(BCA法)

试剂盒：碧云天（BCA蛋白浓度测定试剂盒，货号：P0010）或BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型，货号：P0012)
①BCA试剂A②BCA试剂B③蛋白标准品（5mg/mL BSA，BSA为牛血清白蛋白，bovine serum albumin）。BCA试剂A和B室温保存，蛋白标准于-20℃冻存（提前可以配置为梯度BSA溶液，于负20度保存）；④5XSDS变性剂（碧云天，货号：P0015）

检测原理 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

检测流程：

  1. 根据样品数量，按试剂A：试剂B=50：1的比例进行稀释（检测的时候，此工作的体积为180µL，样品以及标准品的体积为20µL，因此要按照这个体积以及相当样品数来进行稀释），BCA工作液室温24小时内稳定（标准品的梯度为8个，样品是N个，则BCA工作液的体积一般是200x(8+N+1)µL）。注：根据试剂盒的说明进行操作，例如我使用的P0010试剂盒，里面是要求加200µL的反应液。
  2. 取提前配置好的蛋白标准品梯度溶液，即0µg/µL（编号1），0.025µg/µL（编号2），0.05µg/µL（编号3），0.1µg/µL（编号4），0.2µg/µL（编号5），0.3µg/µL（编号6），0.4µg/µL（编号7），0.5µg/µL（编号8）。
  3. 在96孔板相应的孔中加入200µL的BCA工作液，然后将编号为1到8的标准品加入到这些孔中，体积为20µL；
  4. 将样品稀释10或20倍，然后将20µL的样品加入到样品孔中（注：在这一步的操作中，通常是先在96孔的孔中提前加入9μL或19μL的双蒸水，然后再加入1μL的样本，最后加入200μL的反应液）；
  5. 在37℃条件下放置30分钟；
  6. 测定OD562nm处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度，这一步注意，通常我们是使用y = ax+b来计算的，也就是x轴是吸光度，y轴是蛋白浓度，计算后再乘以稀释倍数即可。

（三）蛋白变性

  1. 将准备上样的所有蛋白样品调至等浓度（一般上样量最多是20µg，体积是10µL，因此蛋白的终浓度控制在2µg/µL，但根据Biorad公司的说明，1.5mm的胶，大梳子每个孔最多上样66uL，但推荐最大上样是50μL，小梳子最多一个孔上样40μL），蛋白与5×SDS－PAGE Loading Buffer以4:1 混匀（体积比），1×loading buffer补充至等体积，SDS要在不超过37度的水浴中进行融化，用完放到负20度即可。

建议：蛋白样品在加入SDS之前最好统一稀释至浓度为2.5µg/uL（因为最终上样体积为10uL，上样蛋白为20ug，其中在变性前，1次实验的蛋白样本为8µL，需要加入含有5XSDS的Loading Buffer为2uL，因此蛋白浓度最终就是2µg/µL）。每次制备的样品需要按3次实验进行分装，即每个试管中装24uL，每支的浓度为2.5µg/µL，使用的时候，直接加6uL的Loading Buffer，一次上样为10uL;如果细胞数量较多，蛋白浓度较大，可以将5XSDS稀释为1XSDS,并对蛋白样本进行稀释后再变性。

  1. 100℃干热或水浴（封口）10min充分变性，12000g离心30s后，置于冰上或4℃保存。

（四）SDS-PAGE胶配置

  1. 清洗玻璃板：根据实验需要选择一定厚度的玻璃板 （1.0mm，1.5mm），注意一定要将玻璃板洗净（洗洁精），最后用无水乙醇冲洗，与胶接触的一面向上置于干净的纸巾晾干或用电吹风吹干。
  2. 装置玻璃板：将两块玻璃板装好，低的玻璃板朝内，注意玻璃底部平整，防止漏胶，四个螺丝钉一起拧紧，防止玻璃破裂，再固定于制胶板上，可同时做一块胶（对面有塑料挡板）或两块胶，在加入分离胶之前，可以加入无水乙醇，观察一下是否漏液；如使用Bio-Rad, 将两块玻璃板装好，低的玻璃板朝外，夹好玻璃。
  3. 配分离胶：分离胶的其它成分可事先配好（事先配置好的意思就是，先把除了10% AP（过硫酸铵）及TEMED外的其它成分加好，在实验之前再加入AP与TEMED），避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3min），加入10%AP及TEMED即可，也可临时按比例配制，注意胶用枪吹打混匀（鉴定的Rab32蛋白是按照10%SDS-PAGE的胶进行配置，体积为5mL，不同的蛋白分子量需要不同浓度的胶，通常是分子量越大的蛋白，需要浓度越低，同时胶也越脆弱）注：试剂盒的A盒（即带有TEMED的那个试剂盒）放4℃保存；B盒常温下保存。
  4. 灌胶：将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，灌入分离胶后（可预先插入梳子，梳子底下约0.5cm处标记预备配制的分离胶高度，拔出梳子）应立即封胶，可用在液面上小心注入一层无水乙醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置，封胶后切记勿动，分离胶的上层距离低的玻璃板的最上层距离约为1.5~2cm，配置分离胶的体积约为5mL，用掉约4.5mL。
  5. 待分离胶凝后（30min左右出现一条明显的分离线）将无水乙醇倒掉，用滤纸或纸巾吸干。
  6. 配浓缩胶： 同前按比例配制浓缩胶，一个板子约2mL，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子（不同厚度的玻璃板匹配不同厚度的梳子），注意不得在齿尖留有气泡，静置1h以保证完全聚合。

(5) 电泳

电泳：上样前将胶板下的气泡赶走，用注射器吸取电泳缓冲液冲孔，可根据实验需要设定阳性对照（即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞，同时可以提示你一抗的质量）或阴性对照（即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞），样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker（Ferments）也用1×loading buffer调整至与样品等体积，上样完毕后宜尽快电泳（注意电极正负）防止扩散，以初始电压为80V进行稳压电泳，当溴芬兰泳动至分离胶时，这个过程约为20min~30min，改电压为120 V继续稳压电泳，最终的蓝色缓冲液条件不要超过底部支架的绿色部分，电泳的过程约为60min~90min，整个过程要注意电泳的条件位置，不同分子量的蛋白电泳的时间与位置不同。

(6) 转膜

  1. 取胶：在目的条带充分分离后（参考Marker的分离效果），或电泳至溴酚染料前沿下至凝胶末端处可结束电泳，将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），在转移液（转移液即1X的transfer buffer，要现用现配）中浸泡。
  2. 转膜：转膜液是800mL的1X转膜液加上200mL的甲醇，根据胶的大小剪裁稍大的PVDF膜，在左上角剪角，甲醇中充分浸泡5min（活化PVDF膜）后转入转移液中，去掉PVDF膜的上下两层塑料封纸，将厚的白色滤纸及海绵也浸入转移液中。15min-30min后按如下顺序安装转移装置（如图1所示）：

a.平放底部电极（负极），放一张海绵垫片。
b.在海绵垫片上放置1张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。
c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上，排除所有气泡。
d.把PVDF膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。
e. 把最后1张滤纸放在PVDF膜上方，同样须确保不留气泡。
f.放上另一张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。保证对凝胶有一定的压力。加入预冷的转膜液及内置的冰盒，盖好盖子，连接电源，（注意正负极）电转移40min, 300mA（根据实验需要摸索最佳转膜条件）。电转过程中，尽量保持低温环境，可放在冰水里转膜。电转结束后，断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。要观察膜上蛋白的情况可将膜在丽春红中染色，然后蒸馏水冲洗。（电泳上槽液及转膜液可回收）。

  1. 如果不染色，可以跳过后面几步，直接进行封闭。染色和脱色 ：电泳完毕可通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹后的胶或膜染色。
  2. 考马斯亮蓝染色：将凝胶取出放入塑料盒中倒入少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4℃过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止。（染色液可回收）
  3. 丽春红染色：详细方法见说明书。

(7) 膜的封闭

在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% Non-fat milk等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，本实验室常用封闭液5%Non-fat milk。封闭过程如下所示（与胶接触的PVDF膜的一面是正面，要在正面的左上角剪下一小块，作为区分正反面的依据，前面剪过的则忽略此步）：

  1. 洗转印膜：用1xTBS-T室温漂洗3次×10min（漂洗1次也行），以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
  2. 取漂洗的转印膜，放入5% Non-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4℃过夜， 或使用商用封闭液。
  3. 封闭后，使用1×TBS-T室温漂洗3次×10min。

(8) 抗体杂交

抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1，即一抗）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2，即二抗）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素酶及生物素等。 （抗体稀释倍数需要摸索通常一抗浓度1：2000到1:1000，具体的稀释浓度可以参考一抗的说明书，二抗浓度1:1000）。杂交过程如下所示：

  1. 封闭后的杂交膜放入塑料盒或杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Ab1（宜设立内参照，beta-actin，beta-tubulin等），4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2h。（一抗可回收3-5次）；
  2. 1×TBS-T洗膜3次×10min；
  3. 抗体稀释液稀释的Ab2（抗兔-HRP或抗鼠-HRP，根据一抗种属来源决定，注意避光）室温2h，随后洗膜3×10min。
  4. ECL显色：将显色剂A、B按1：1 混匀，将杂交后PVDF膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，约1-5min用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，在暗室中使胶片曝光1-5min。注：不同的显色仪参数不同，需要阅读一下说明书，找到最优曝光条件。

WB常见问题

  1. 如果我想观察2个蛋白，但这两个蛋白的分子量离得很近，怕剪膜剪坏，如何操作？

    答：通常这种情况，可以先孵A蛋白，然后将A蛋白的抗体洗掉，再进行封闭操作，随后孵B蛋白的抗体。

    洗抗体通常会使用抗体去除剂来进行操作，这样通常可以重复利用膜3-5次。抗体去除剂通常有中性，酸性，碱性，要根据自己的目的来进行选择，官网通常就有，例如碧云天的官网《碧云天生产的各种Western一抗二抗去除液的主要特点、差异和选择》。

  2. 如果我想用5%的脱脂奶粉来配制一抗和二抗，但由于担心不好保存怎么办？

    答：如果要用奶粉来配制抗体，通常会加入叠氮化钠。实验室配制的叠氮钠是10%的储备液，常温放置备用，配制一抗时每1mL加入叠氮化钠10μL,能使一抗保存时间一个月左右，使用叠氮化钠时一定要小心，此试剂有毒。

  3. 转膜时间与蛋白分子量有没有关系？

    答：通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大， 需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

  4. 转膜的效率与分子量大小有关系没？

    答：如果是大蛋白（大于100 kDa），需要注意以下几点：

    1. 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8% 或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。
    2. 大蛋白易在凝胶里形成沉淀，从而影响转膜。转膜时在电转移缓冲液加入SDS 至终浓度0.1%，避免出现这种情况。甲醇易使SDS 从蛋白上脱失，因此相应降低甲醇的浓度至10% 或更低，以防止蛋白沉淀。
    3. 降低电转移缓冲液中甲醇的比例，这样可以促进凝胶的膨胀，更易于大蛋白的转出。
    4. 只有使用硝酸纤维素膜时，甲醇才是必需的。如果是PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF 需用甲醇活化。
    5. 选择湿式，4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。

参考资料

  1. Western Blot实验——蛋白转膜和染色篇