病毒包装笔记(5)-293FT的病毒包装

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实验原理

293细胞简介

293FT细胞系非常适应用于慢病毒的生产。该细胞系是由293F细胞系培育而来的，293FT能稳定地表达SV40大T抗原（来源于 pCMVSPORT6TAg.neo plasmid）。此细胞表达SV40大T抗原是由CMV启动子控制。

293FT细胞的培养基：

  1. DMEM（高糖）；
  2. 10%FBS（不能热灭活）；
  3. 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)；
  4. 6 mM L-glutamine；
  5. 1 mM MEM Sodium Pyruvate；
  6. 1% Pen-Strep (optional)

293FT细胞的冻存

90% 完全培养基+10% DMSO（实验室通常是用90%FBS+10% DMSO）

实验材料

293FT细胞，PSPAx2；PMD2G；目的质粒

实验流程

  1. 第1天：用无抗生素DMEM+10% FBS血清铺板293FT细胞（6孔板），细胞接种数量约为5X10e5，确保第2天细胞密度达到80-90%的融合。
  2. 第2天：溶液【1】240ul OPTI-MEM+10ul lipofectamine 2000 per well （总体积 250ul）（室温下静置5min）；溶液【2】OPTI-MEM+4ug质粒per well（总体积250ul）；
  3. 将溶液【1】加入到溶液【2】（顺序不能加错），轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min；
  4. 与此同时，将6孔板中的培养基更换为无抗生素无血清的培养基，约1mL；
  5. 将溶液【1】和溶液【2】的混合液逐滴加入到孔中，轻轻援培养板，混匀，后将细胞放入 37℃，5%的CO2中保温5-6 小时；
  6. 6小时后，更换含有血清的全培养基，继续放在 37℃，5％的CO2中培养48~72h；
  7. 转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上；
  8. 经过48小时后，收集含病毒的培养液（每个孔里包一种病毒）至1.5mL EP管中，8000rpm室温离心3分钟，然后取上清(1mL)（离心是为了清除293FT细胞，如果不离心，容易在宿主细胞中混入293FT）。
  9. 将6孔板中的宿主细胞的培养基吸掉1mL（原来是2mL，除去一半），将含有病毒颗粒的1mL上清加入到宿主细胞中（6孔板，宿主细胞放到6孔板中，每孔5E5细胞，细胞密度不能太高，一般20-30%）中进行感染，并同时加入10uL的polybrene（终浓度为2-5µg/ml polybrene）， 充分摇匀后置于37℃温箱孵育;
  10. 如果目的质粒带有抗性如Ppuro，则用含嘌呤霉素抗性的培养基进行筛选，如果目的质粒带有荧光，则用FACS筛选。