实验原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用硅酸纤维膜吸附或者酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。
实验材料：
试剂盒E.Z.N.A.® Plasmid DNA Mini Kit I（OMEGA Bio-tek）
Epoch微孔板分光光度计（BioTek）
1.5mL管
5mL 离心管
实验流程：
- 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的5ml的LB培养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm）孵育16h。括DH5α。
- 将5.0ml细菌室温10,000 g离心1min，放到5 mL的EP管中，如果菌液多，则分两次加入。
- 轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。
- 加入250μL 的溶液I/Rnase A重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。（注：溶液Ⅰ的成分及作用为：①50mM 葡萄糖—-增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；②10mM EDTA—-抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，③25mM Tris-HCl，pH=8.0—-提取适当的缓冲液体系和PH；④RNase—-除去RNA，此成分不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去）
- 加入250μL溶液II（在孵箱中预热），倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。可能需要孵育2min。不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。（溶液II的成分及作用为为①0.2M NaOH—-裂解细菌，使双层膜变化为micelle微囊；②1%SDS——结合蛋白质（平均2个氨基酸结合上一个SDS），和钾离子形成十二烷基硫酸钾PDS,进而形成大量的沉淀。）
- 加入350μL溶液III，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。（溶液III的成分及作用为：①3M醋酸钾—-钾离子和SDS形成PDS，大量的沉淀；②2M醋酸—-中和NaOH，防止基因组DNA断裂。）
- 室温≥13,000g离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。
- 将HiBindDNAMini Column 加入到2mL的收集管上。
- 小心翼翼的吸取上清液（注意不要吸到沉淀，如果不放心，可以将上清吸到另一新的EP管，然后再离心一次，吸取上清），加入装配在2ml收集管中的小量纯化柱I中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。
- 室温下10,000g离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。再将裂解液加回柱子，再离心一次。
- 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管。
- 加入500μL HBC缓冲液清洗柱子。( HBC的成分没有查到，但根据相关的信息，HBC的成分应该是酚，氯仿，异戊醇的混合用；它们的作用分为：①酚—-使残余的蛋白质变性（远强于氯仿）；②氯仿—-和酚混合使用，增加比重。酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开；③异戊醇—-可以使用酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的比例抽提质粒DNA，在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。)
- 室温13,000 g离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA以适合于下游的应用。
- 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管。
- 加入700μL DNA Wash Buffer。DNA清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA清洗液稀释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。(wash buffer的作用：加入无水乙醇后,终浓度差不多就是70%的乙醇溶液了,在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,wash buffer就是洗去这些盐杂质的。)
- 室温10,000g离心1分钟。
- 丢弃滤过液。
- 将空柱子≥13,000 x g离心2min，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可遗漏。
- 将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中，60℃孵育5min。
- 将80μL无菌去离子水直接加入柱子基质上。
- 60℃孵育5min。
- ≥13,000 x g离心1min洗脱DNA。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA。
- 检测质粒浓度，A260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。将质粒稀释到400ng/uL。
测序
取10uL的质粒样品，送到测序公司即可。