中性粒细胞笔记

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中性粒细胞背景

中性粒细胞（neutrophils）是循环中白细胞中最非常的细胞。19世纪晚期，Paul Ehrlich用新发明的细胞染色方法研究白细胞（leukocytes）中的亚群，他发现白细胞中存在着一些亚群，其中的一类他称为“多型核细胞”（polymorphous nucleus），即中性粒细胞。

中性粒细胞特征

  1. 细胞核呈多核；
  2. 含有颗粒状的细胞质，里面含有抗菌物质。
  3. 细胞数量：小鼠循环血液中占30%，人类的则占70%.

活化

炎症部位，细菌来源的物质以及宿主产生的炎症信号非常丰富。这些物质及信号包括LPS，fMLP，TNF-alpha，IL-1beta，IL-17会促进内皮细胞产生黏附因子（adhesion），即P-选择素，E-选择素，一些整合素家族的成员（ICAMs）。中性粒细胞表面有两个分子：PSGL-1，L-选择素，这两个分子可以识别内皮细胞的炎症信号，一旦中性粒细胞与内皮细胞随机接触，这两个物质就分别与P选择素和E选择素结合，将中性粒细胞固定在内皮表面。接着中性粒细胞会在内皮表面进行翻滚。

PSGL-1和L-选择素的接触会诱导各种激酶的活化，包括Src家族汽配Syk，还有PI3K，以及p3丝裂原激活蛋白激酶，这种级联反应会改变中性粒细胞的生物学特征，并使细胞进入整合素活化阶段，产生更牢固的黏附。

牢固结合的阶段是由beta2整合素家族蛋白介导的（LFA-a和Mac-1），牢固结合之后就是跨内皮细胞的迁移。随着中性粒细胞在内皮上的翻滚，加上趋化因子，细胞因子，细胞产物的作用，中性粒细胞表面的beta2整合素开始聚合，它的配体是ICAM-1。之后，中性粒细胞产生尖锐边缘的片足，趋化因子受体和吞噬受体会在片足上集合，细胞骨架会重构，向着趋化因子浓度梯度的方向进行迁移，从而诱发中性粒细胞的氧爆作用(oxidative burst)。

中性粒细胞的招募示意图如下所示：
NET为neutrophil extracellular traps。

中性粒细胞的杀菌物质

三种颗粒：

  1. Azurophilic granules (嗜天青颗粒，也称为as peroxidase-positive或primary granules) ，尺寸最大，直径约为0.3 μM，这是中性粒细胞成熟中最先生成的颗粒，含有 myeloperoxidase (MPO)。
  2. specific颗粒
  3. gelatinase颗粒。

中性粒细胞的分离

根据中性粒细胞的来源（外周血，骨髓，腹腔），中性粒细胞的分离有三种方法：

从骨髓中分离中性粒细胞

实验原理

Histopaque主要由葡聚糖、泛影葡胺钠组成，并调整成不同的密度，利用密度梯度离心或双重梯度离心技术，从人、大鼠、小鼠或其他小型哺乳动物全血中分离纯化单核细胞、淋巴细胞和粒细胞等。

实验材料与试剂

  1. Histopaque 1077（密度梯度离心液，Sigma- Aldrich, catalog number: 10771 ; MP Biomedicals, catalog number: 091692254，这个型号是1077）
  2. Histopaque 1119
  3. 无菌PBS（HBSS或Hanks液）
  4. 离心机
  5. 双抗
  6. 1640培养基
  7. 剪刀，15cm离心管

实验步骤

  1. 处死小鼠，取出小鼠的股骨和胫骨；
  2. 放75%的酒精中消毒，随后再放入无菌PBS冲掉多余的酒精；
  3. 剪掉骨头的一头，用PBS冲洗骨头，冲洗三次；
  4. 四摄氏度，2000rmp离心5分钟，去掉上清；
  5. 用2mL的无菌PBS重悬；
  6. 在15mL的离心管底部中加入3mL的Histopaque 1119；
  7. 其次，缓慢加入3mL的Histopaque 1077；
  8. 最后，缓慢将2mL的细胞悬液加入到Histopaque 1-77的上层；
  9. 2000rpm，no brake,no accelerate，4摄氏度，离心30分钟；
  10. 在 Histopaque 1119和Histopaque 1077界面处取白色层的细胞；
  11. 用加入了双抗的1640培养基冲洗1次（1400rpm，7min，4摄氏度）；
  12. 取合适量细胞流式染色Ly-6G和CD11b；
  13. 30min后清洗细胞，上机检测细胞纯度。
    Histopaque的加入分层如下图右图所示：

外周血中性粒细胞的分离

实验步骤

  1. 收集4mL的PMBC，加入肝素化的试管中；
  2. 在15mL的离心管中加入4mL的Histopaque。
  3. 将PMBC轻轻加到Histopaque的上层（要注意Histopaque与PMBC呈现明显的两层，动作不能过大）。
  4. 100g，离心30分钟，刹车与加速都要调到最小。
  5. 吸取白色的细胞层（位于Histopaque和培养基之间，如下图的左图所示），这一步要在10分钟内完成 。
  6. 用PBS清洗细胞两次（100g，10分钟），4mL的PBMC约能取到1X10e7-8个细胞。

注意事项

  1. Histopaque与所要离心的外周血体积比为1:1。
  2. Histopaque的储存温度是4摄氏度，在使用之前，要将Histopaque置于室温下1到2个小时，使其温度与室温接近，因为PBMC在低温下会发生冷休克（cold shock），并有可能在离心过程中形成聚集物。

中性粒细胞杀伤作用评价

（Blank, B. S., et al. (2014). “Misregulation of the broad-range phospholipase C activity increases the susceptibility of Listeria monocytogenes to intracellular killing by neutrophils.” Microbes and Infection 16(2): 104-113.）

  1. 纯化后的BMN（骨髓来源中性粒细胞）用1640培养基混匀（加10% FBS，10mM HEPES），抑肽酶（aprotinin）浓度为0.4ug/mL，浓度为2X10e7/mL。
  2. 加入细菌，离心10分钟，700g。
  3. 孵育25分钟（吞菌）
  4. 用Opti-MEM培养基（含有50ug/ gentamicin）来替代原来的培养基；
  5. 感染25分钟后（从离心后开始计算时间），用含有200ug/mL的gentamicin的完全培养基清洗细胞；，
  6. 继续孵育30分钟，杀死细胞外细菌；

中性粒细胞的流式鉴定

参考资料

  1. Amulic B, Cazalet C, Hayes G L, et al. Neutrophil Function: From Mechanisms to Disease[J]. Annual Review of Immunology, 2012, 30(1):459.
  2. http://www.bioon.com/trends/news/609626.shtml
  3. Panda, S. K., S. Kumar, N. C. Tupperwar, T. Vaidya, A. George, S. Rath, V. Bal and B. Ravindran (2012). Chitohexaose activates macrophages by alternate pathway through TLR4 and blocks endotoxemia. PLoS Pathog 8(5): e1002717.
  4. Boari, J. T. and Rodríguez, E. A. (2012). Adoptive Transfer of Isolated Bone Marrow Neutrophils. Bio-protocol 2(23): e298. DOI: 10.21769/BioProtoc.298; Full Text
  5. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., Bermejo, D. A., Ramello, M. C., Montes, C. L., Cejas, H., Gruppi, A. and Acosta Rodriguez, E. V. (2012). IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog 8(4): e1002658.
  6. Swamydas M, Lionakis MS. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. Journal of Visualized Experiments : JoVE. 2013;(77):50586. doi:10.3791/50586.