慢病毒背景
慢病毒包括灵长类慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)，以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。目前，HIV-1、HIV-2、SIV、FIV及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体，而其中又以HIV-1最为热门。
|
|
HIV-1病毒形态与结构
现在的慢病毒包装系统通常是由HIV-1病毒改造而来的，因此有必要了解一下HIV-1的结构与功能。HIV-1的基因组由两条相同的正股RNA链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。病毒基因组全长约9200bp，含有gag、pol、env 3个结构基因以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu6个调节基因。在病毒基因组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列，称为长末端重复序列(longterminalrepeat，LTR)。
HIV-1的病毒结构如下所示
各个元件的作用：
编码病毒的基本结构：
- gag基因编码病毒的核心蛋白，即p55的蛋白前体，经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)。
- pol基因编码病毒复制所需的酶类，例如包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase)
- env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。编码p55的蛋白前体，经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)。
调节基因
- tat基因编码的gp14是一种反式激活的转录因子，与LTR结合后能促进病毒所有基因的转录。
- rev基因编码的产物gp19能促进未经拼接的大mRNA分子从细胞核向胞浆转运，并相对减少拼接后小mRNA分子的数量。
- nef基因编码负调节蛋白，对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。
- vif编码产物与病毒体的感染性有关，vpu产物与病毒的装配、成熟和释放有关，而vpr编码产物的功能尚不清楚。
HIV-1生活史
HIV-1病毒通过gp120与宿主细胞的CD4分子和趋化因子受体结合，然后将病毒的基因(RNA)、蛋白及酶等释放到宿主细胞内;随后，逆转录酶将病毒RNA转录成DNA，病毒DNA在整合酶的作用下插入宿主细胞核的基因组中，此时的病毒DNA也称为原病毒;紧接着，原病毒转录成mRNA，mRNA从细胞核进入细胞质，并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质)，新合成的各种蛋白、酶及RNA等聚集在宿主细胞的膜下，病毒的包膜蛋白(gp120，gp41)插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟的病毒(此时病毒无传染性，这也是包病毒中病毒包膜质粒的作用);最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短，便形成成熟的病毒。病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来，离开该细胞去寻找新的宿主。
慢病素是操作基因的工具
引入外源基因
慢病毒和逆转录病毒基因递送系统利用了逆转录病毒复制方面的性质以获得目标核酸序列稳定的整合。核酸转染只能获得瞬时的转基因表达（这种转染能在宿主细胞中引入外源基因，但无法稳定遗传），而基于逆转录病毒和慢病毒的系统却可以获得外源基因稳定的整合，外源基因于是被遗传下去随重复的细胞分裂持续表达。慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要特征是他们产生的是复制有缺陷的，即自身无活性的病毒颗粒。这使得目标序列得以转运，而在目标细胞中不存在连续的病毒复制。
用于RNAi的研究
慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由rna聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构(stem loop)。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。
慢病毒载体的构建
慢病毒载体（Lentiviral vector,LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。
慢病毒包装系统的组成
该系统由[1]包装质粒、[2]载体质粒、[3]包膜质粒及3种质粒组成。
包装质粒：这一部分能够表达出各种病毒酶蛋白。包装质粒由HIV基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白表达HIV复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu。它由HIV前病毒基因组作简单修改得到，其5′端LTR由（LTR本身也有启动子活性）异源病毒启动子/增强子元件取代。为了防止来自辅助质粒的RNA衣壳化，特意将5′端主要剪接供体位点(splice donor site)和gag编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψ region)删除，而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(polyA)取代。另外利用点突变将env编码序列打断，但仍然保留rev反应元件。这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白，包括tat及rev(env除外)。
载体质粒：该质粒用于将目标基因递送至靶细胞。载体成分与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低载体质粒与包装质粒这两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，因此需尽量减少两者的同源性，例如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。它携带了5′端LTR和全部5′端非翻译区域(包括gag编码序列的350个核苷酸)，另外还带有rev应答元件(Revresponsiveelement，RRE)及3′端LTR，其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV)启动子及增强子元件，在某些研究领域，可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因作为生物标记。
包膜质粒:病毒载体可以借助其他病原体的外壳蛋白包装成假病毒，以改变其嗜性。最常用的是疱疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G）。,env由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。本系统包膜质粒的改进之处在于，引入了VSV-G基因表达包膜结构，这样做的结果至少具有3个方面的积极意义:
①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能;
②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞;
③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。
第二代HIV-1来源的慢病毒载体
尽管第一代载体产生RCR的几率极小，仍然不能忽略产生的可能性。毕竟包装质粒可以表达除env外所有HIV-1病毒蛋白，其中部分蛋白与HIV-1的毒力密切相关，且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用，比如:vpr可引起细胞周期停滞，vif能抑制某些细胞的生长而Nef能引起凋亡。1997年，Zufferey等将包装质粒上的vif、vpr、vpu和nef基因敲除，从而得到第二代慢病毒载体，而其他方面与上述第一代载体系统一致。研究发现即使全部4个调节基因都被敲除。病毒颗粒的产量也不会受到影响。这种载体仍然具有体外感染非分裂期细胞、在体感染分化成熟大鼠神经元的能力，但是目前尚不能确定这种载体是否能转染全部种类细胞。由于敲除的调节基因与野生型HIV-1病毒的生活周期以及毒力密切相关，所以这些载体即使发生多位点重组形成RCR，亲代病毒仍不具有致病性。
第三代HIV-1来源的慢病毒载体
利用慢病毒来源的包装系统的最大问题在于生产过程中可能产生复制型病毒。当质粒DNA转染进入包装细胞，以及辅助质粒及载体质粒的RNA包装入同一病毒颗粒时，将有可能发生重组。减少这种可能性的方法之一就是减少辅助质粒与载体质粒的同源性。另一个方法便是将gag/pol和rev编码序列隔离，分散在不同的质粒。这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统。质粒一携带了gag/pol编码序列及RRE;质粒二包含了编码rev的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。采用四质粒代替三质粒系统、除去tat均减少了产生复制型病毒的可能性，从而增加了载体系统的安全性。
自身失活型(SIN)慢病毒载体
由于具有逆转录方式的特点，在逆转录过程中存在于病毒基因组3′端U3区的启动子/增强子元件将被复制，并置于前病毒两端的LTR。因此，3′LTR的U3区启动子发生失活突变后，将在逆转录过程中转移至5′LTR。如果这样的载体整合入靶细胞，将不会产生完整长度的载体RNA，因此命名为“自身失活型载体”。这种技术最先应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV)载体和鸟类的脾坏死病毒(SNV)载体。进一步研究表明，U3区的频繁突变将导致病毒滴度下降，原因是该区域的某些序列是载体有效多聚腺苷酸化所必需的。在HIV-1基因组内，核心多聚腺苷酸化信号存在R区。现已证实，U3区序列能影响多聚腺苷的酸化效率。与MoMLV相比，将HIV-1的3′LTRU3区(除上述多聚腺苷酸化增强相关序列，以及病毒整合酶识别的U3区5′末端外)删除后并不会影响滴度。这种删除能确保病毒RNA逆转录并整合入靶细胞染色体后，从5′LTR端启动子起始的复制被有效抑制。这种设计的另一个优势是能增强瞬时表达效率，这可能与减少了病毒LTR和细胞启动子之间的启动子竞争有关。
慢病毒载体的包装
大部分研发人员目前都使用瞬时转染293T细胞的方式生产病毒载体。这种方法的缺点在于生产获得的病毒载体可能会出现有缺陷的基因组。为了生产高质量的载体，必须筛选合适的包装细胞系，而建立包装细胞系的最大难点在于某些病毒蛋白具有细胞毒性。比如，vpr能诱导细胞停滞在G2期，不利于建立vpr蛋白高表达的细胞系，病毒蛋白水解酶同样能水解细胞内的蛋白，不利于建立稳定表达病毒gag-pol蛋白的细胞系;VSV-G蛋白的表达同样对细胞具有毒性。目前，为了建立合适的慢病毒载体包装细胞系，许多科学家都在尝试使用诱导型或可调节的启动子来克服病毒蛋白的细胞毒作用。
慢病毒的包装过程
所用质粒
本实验室现在使用的慢病毒包装系统为三质粒系统，三个质粒分别为①psPAX2（包装质粒），②pMD2G（包膜质粒），③目的质粒（载体质粒）。从网上的信息来看，这是第二代慢病毒包装系统。
慢病毒载体滴度的测定
慢病毒载体滴度可以参考腺病毒载体滴度的检测方法，将病毒与293细胞共培养后，通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外，还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。
病毒包装的简单流程
本文只是背景资料搜集，因此不涉及具体的实验操作。大致操作如下：
- 转化：目的在于将质粒进行扩增，质粒的本质就是DNA，在一定条件下可以进行大量扩增，因此在拿到质粒的第一件事情就是先扩增出大量的质粒进行备份（前提是这个质粒的序列是对的）；常用的宿主细胞是DHalpha大肠杆菌。
- 孵育293FT细胞。细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。这种细胞是已经被筛选出来专门用来合成病毒的。将1中的质粒转染到293FT细胞中，进入病毒包装，提取病毒，进入下一步的转染操作。
- 目的细胞：就是自己最终实验所用到的细胞，例如DC2.4细胞。将包装好的病毒对目的细胞进行感染。
- 分离目的细胞：质粒上通常带有报告基因，例如GFP，成功被病毒感染的细胞通常会表达这些绿色荧光蛋白，通过FACS就可以将细胞进行筛选出来，然后继续养细胞，长到一定密度后，再通常一定手段（例如WB或qPCR来鉴定目的基因是否导入或者是目的基因是否被敲除，这取决于具体的实验设计）。
附录：常见质粒元件
SV40
SV40的全称是Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40，即猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。