病毒包装笔记(2)-质粒

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背景

1952年Joshua Lederberg创造一个词“质粒(Plasmid)”，它指的是任何染色体外的遗传决定物质，共价、闭合、环状双链DNA（cccDNA），大小从1kb~1000kb。质粒是一种独立于染色体外独立复制的双链DNA片段，通常都含有基因。尽管质粒在细菌、古细菌和真核细胞中都有发现，但质粒对于细菌的生物学意义更加重要，因为细菌与细菌之间可以通过鞭毛等相互交换质粒信息，而这种遗传信息的交换是有利的，因为质粒上面含有耐药基因等信息。

但天然存在的野生型质粒有着一些缺点，例如分子量大(＞15kb)、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求。因此需要进行改造：

  1. 去除多余的和功能研究无关的片段删除掉，将质粒的长度从15kb缩短到1~5kb。
  2. 给它添加上各种元件，例如安装各种酶切位点，遗传标记，例如抗性基因（氨苄霉素、卡那霉素、四环素…）、报告基因（luciferase、EGFP…）等。

质粒的分类（原核/真核/穿梭载体）

  1. 克隆载体：能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体，这类载体没有启动子等启动转录、翻译的元件。
  2. 表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA序列。
  3. 穿梭载体是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭载体不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。
  4. 基因下调载体：用于减少某个内源基因的表达，该载体上含有针对目标基因mRNA的shRNA，起到基因沉默的作用，下调基因的蛋白表达。
  5. 病毒质粒：基于病毒的基因组改造而成的质粒，可以独立包装成为病毒颗粒，巧妙地去除了病毒的感染致病性却保留了病毒的其他功能，为功能基因的灵活进入细胞并整合到基因组中提供了非常方便的工具。

　质粒的命名

pUC19、pEGFP-N3。小写字母p代表质粒”plasmid”，2~4个大写字母代表发明者、实验室名称或者其他表型性状（EGFP是增强型绿色荧光蛋白）。

质粒图谱

质粒图谱如下所示：第一张图：

质粒图谱：第二张图：

  1. 箭头。大多数质粒都会有箭头，箭头有两种解释。一种是代表转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。我们还需要提到的是F1启动子（图上的f1 ori）代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA哦，但是可以用来测序。看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。复制起始位点Ori，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：招募复制蛋白，进行质粒的自我复制，增加拷贝数，随着细胞的增殖而增殖；

  2. 抗性基因：加抗性基因的原因是因为质粒对于一般细胞来讲不是必需元件，在没有抗生素的培养基中不断增殖的过程中，质粒载体慢慢就丢失了，只有培养基里面加入抗生素，抗性基因赋予宿主菌分解抗生素的能力，细胞才会需要该质粒。常见抗性基因有：Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性；tetr 可以阻止四环素进入细胞；camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性；neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活。

  3. 多克隆位点（MCS）：它具有多个限制内切酶的单一切点，便于要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选，最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。

  4. 是否含有表达系统元件，即启动子（promoter）－核糖体结合位点（RBS）－转录终止信号（AATAAA同时是poly A）。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。启动子是促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子－是真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。克核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体。转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。

  5. 报告基因：例如β-半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等，便于迅速检查功能基因是否表达的阳性判断，表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置，直接看EGFP、luciferase的荧光就ok。
  6. 引物结合区（primer）：一般位于多克隆位点区的上、下游，便于通用引物的PCR验证、测序验证之用。

质粒的查询

Vectorpedia
http://www.addgene.org/pgvec1?f=v&cmd=listvecinfo

google
检索式子：质粒名 ＋ map
质粒名 ＋sequence ＋filetype:txt or filetype:pdf 或者：进入 google，点击图片搜索，直接查找图谱。

google scholar
有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时，可以在 google scholar 中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源; 或者籍此向作者咨询或索取。

大量图谱：http://www.embl-hamburg.de

PET 系列载体信息：http://www.merckbiosciences.com/g.asp?f=NVG/pETtable.html

转染

以转染293T细胞为例，使用Lipofiter (汉恒)/DNA转染试剂（biotool），或lipo2000/3000，Fugen HD等转染试剂。

参考资料